你们好，最近小活发现有诸多的小伙伴们对于western blot详细步骤，western blot这个问题都颇为感兴趣的，今天小活为大家梳理了下，一起往下看看吧。
1、 1.蛋白质样品制备：细胞裂解物用于裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。然后确定每个蛋白质样品的蛋白质浓度。
2、 2.电泳(1)SDS-PAGE凝胶的制备SDS-PAGE凝胶(分离凝胶和浓缩凝胶)可以参考一些文献进行制备。
3、 (2)样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量的浓缩SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如，2X或5X SDS-PAGE蛋白加载缓冲液。使用5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减少上样体积，
4、 在相同体积的装载孔中可以装载更多的蛋白质样品。5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可参照相关文献配制，100或沸水浴加热3-5分钟，使蛋白充分变性。(3)上样和电泳(1)冷却至室温后，
5、 蛋白质样品可以直接装载到SDS-PAGE凝胶装载孔中。为了观察电泳效果和膜转移效果，判断蛋白质的分子量，最好使用预染的蛋白质分子量标准。
6、 (2)电泳时，通常建议上层胶采用低压恒压电泳，溴酚蓝进入下层胶时采用高压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似的电泳装置，低电压可以设置在80-100V，
7、 高电压可以设置在大约120伏。
8、 (3)为了方便电泳，整个SDS-PAGE过程也可以保持恒压，通常电压设置为100V，然后计时时间设置为90-120分钟。设置定时可以避免频繁的电泳过冲。
9、 通常溴酚蓝到达凝胶底部附近时可以停止电泳，也可以根据预染蛋白分子量标准的电泳情况预测目标蛋白已经适当分离后可以停止电泳。
10、 3.转移(1)西部实验我们推荐使用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以，但是硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中容易开裂，尤其是用镊子夹住的时候。
11、 请参考制造商推荐的膜使用步骤。通常，如果使用Bio-Rad的标准湿膜转移装置，膜转移电流可以设置为300-400mA，膜转移时间可以设置为30-60分钟。您也可以在15-20mA的温度下过夜转移薄膜。
12、 具体的膜转移时间取决于靶蛋白的大小。目标蛋白分子量越大，膜转移时间越长，目标蛋白分子量越小，膜转移时间越短。(2)在薄膜转移过程中，特别是在大电流快速薄膜转移过程中，通常会出现非常严重的发热现象。
13、 最好将转膜槽放在冰浴中进行转膜。膜转移的效果可以通过使用预染色的蛋白质分子量标准来观察。一般很难将分子量最大的1-2个带全部转移到膜上。也可以通过用丽春红染料溶液对胶片进行染色来观察胶片转移的效果。
14、 也可以用考马斯亮蓝快速染色液对已完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白残留情况。
15、 4.封闭(1)转膜后立即将蛋白膜放入配好的西洗液中，冲洗1-2分钟，洗掉膜上的转膜液。从膜转移后的各个步骤来看，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥。
16、 否则很容易产生更高的背景。
17、 (2)用微型台式真空泵吸干洗涤液，加入西封液，在摇床上缓慢摇匀，室温下密封60分钟。对于一些背景高的抗体，4过夜即可封闭。
18、 5.一抗孵育(1)根据一抗的说明书，用适当比例的Western一抗稀释液稀释一抗。(2)用微型台式真空泵吸出密封液，
19、 立即加入稀释的一抗，并在室温或4下在侧摇床上缓慢摇动并孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不好，可在4缓慢摇动孵育过夜。(3)回收一抗。加入西洗液，
20、 在侧摇床上慢慢摇晃和清洗5-10分钟。完全吸收洗涤液后，加入洗涤液，洗涤5-10分钟。一共洗三遍。如果结果背景高，可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。
21、 6.二抗孵育(1)根据二抗的使用说明，将辣根过氧化物酶标记的二抗用适当比例的Western二抗稀释液稀释。
22、 (2)用小型台式真空泵吸干洗涤液，立即加入稀释的二抗，在室温或4的侧摇床上缓慢摇动孵育1小时。(3)回收二抗。加入西洗液，在侧摆台上慢慢摇洗5-10分钟。在洗涤液耗尽后，
23、 然后加入洗涤液，洗5-10分钟。一共洗三遍。如果结果背景高，可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。
24、 7.蛋白质的检测(1)参照相关说明，可以使用高灵敏度的ECL发光液体如Enlight来检测蛋白质。(2)冲洗胶片时可使用x光自动洗片机。如果没有自动处理器，
25、 显影液和定影液可以通过用于手动胶片显影的显影液和定影液套件来制备。
26、 8.膜回收如果蛋白样品非常有价值，可以用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，重复使用蛋白膜。
以上就是western blot这篇文章的一些介绍，希望对大家有所帮助。
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